ЛАЛ-тест: випробування на бактеріальні ендотоксини

19 лютого 2013 р. компанія «УкрМедСерт» провела семінар «Випробування на бактеріальні ендотоксини. ЛАЛ-тест».

  У ролі лектора виступила Юлія Карпенко, провідний інженер відділу мікробіологічного контролю ДП «Центральна лабораторія з аналізу якості лікарських засобів та медичної продукції». У рамках семінару було розглянуто актуальні питання контролю якості ін’єкційних та інфузійних лікарських засобів за показником «бактеріальні ендотоксини», методи, що для цього використовуються, можливості застосування ЛАЛ-тесту (Limulus Amebocyte Lysate), нормативна база, необхідна для проведення такого контролю.

Доповідач розповіла про відкриття бактеріальних ендотоксинів та етапи розвитку контролю ліків на пірогенність, перерахувала методи, що використовуються для цього, а також висвітлила недоліки та переваги кожного з них. На початку ХХ ст. застосування ряду парентеральних препаратів, наприклад розчину глюкози, призвело до появи такого явища, як ін’єкційний жар. У 1912 р. Е. Хорт (E. Hort) і В. Пенфольд (W. Penfold) опублікували результати дослідження «Мікроорганізми та їх вплив на виникнення жару», з яких можна було зробити висновок, що токсичність пов’язана лише з грамнегативними бактеріями.

Ф. Зіберт (F. Siebert) досліджувала причини пірогенності дистильованої води. У серії робіт, надрукованих у 20-х роках ХХ ст., вона довела, що причиною виникнення ін’єкційного жару насправді було бактеріальне забруднення. Стало зрозуміло, що в грамнегативних бактеріях містяться високомолекулярні комплекси ендотоксинів, які викликають токсичну, пірогенну та імунну реакцію організму.

Пізніше Л. Рейдмахер (L. Rademacher) підтвердив висновки Ф. Зіберт, а також довів необхідність запобігання бактеріальному забрудненню на кожному етапі фармацевтичного виробництва. Крім того, він показав, що стерильність не є гарантією апірогенності. У 1945 р. О. Вестфол (О. Westphal) опублікував наукову роботу, в якій описав полісахаридний комплекс, виявлений у зовнішньому шарі бактеріальної стінки, який проявляв пірогенний ефект. У наступні роки автор продовжив вивчати ліпосахариди, виділені з різних ентеробактерій.

Неочищений ендотоксин складається з ліпідної, полісахаридної та білкової частин. Очищений ендотоксин не містить білка, тому ендотоксини грамнегативних бактерій часто називають ліпополісахаридами, підкреслюючи їх хімічну природу. Молекула ендотоксину термостабільна та легко витримує цикл стерилізації в автоклаві. Малі розміри ендотоксинів дозволяють їм легко проходити крізь мембрани, які використовуються для стерилізації розчинів (0,22 мкм). Тому ендотоксини можуть бути присутні в готових лікарських формах, навіть вироблених в асептичних умовах та після фінішної стерилізації.

Ю. Карпенко розповіла про профілактичні заходи, що проводяться для запобігання утворенню пірогенних речовин, забезпечення апірогенності різних форм лікарських засобів та допоміжних матеріалів. Також було детально описано принцип та механізм реакції, що лежить в основі ЛАЛ-тесту:

• висока специфічність по відношенню до ендотоксинів грамнегативних бактерій;
• висока чутливість методу;
• простота виконання;
• надійність;
• відтворюваність;
• можливість проаналізувати велику кількість зразків у короткий термін;
• більш широка сфера застосування (можливість аналізу лікарських засобів, які чинять седативну дію, стероїдних та радіофармацевтичних препаратів тощо).

Основа ЛАЛ-тесту — здатність лізату амебоцитів (клітин крові) мечохвостів (стародавніх морських тварин, що проживають біля берегів Північної Америки, Японії, Китаю, В’єтнаму, Індії) специфічно реагувати з ендотоксинами грамнегативних бактерій (ліпополісахаридами). У результаті реакції ендотоксину та лізату відбувається помутніння прозорої реакційної суміші або утворення твердого гелю.Сфери використання ЛАЛ-тесту дуже різноманітні. Перш за все, це контроль готової фармацевтичної продукції. Крім цього, ЛАЛ-тест використовують для контролю якості сировини, води для ін’єкцій, перевірки елементів фільтрів на вимивання з них пірогенів, чистоти ампул та флаконів, визначення оптимальних режимів миття, встановлення причин виявлення пірогенів у кінцевому продукті. У клінічній практиці ЛАЛ-тест застосовується для ранньої діагностики захворювань, викликаних грамнегативними бактеріями (перевагою ЛАЛ-тесту порівняно з класичним методом посіву є швидкість).

 Нестандартні сфери використання ЛАЛ-тесту:

• ветеринарія (контроль якості ветеринарних препаратів та діагностика захворювань тварин, викликаних грамнегативними бактеріями);
• оцінка бактеріальної забрудненості середовища;
• дослідження екології мікроорганізмів в океанічній воді та оцінка їх біомаси;
• оцінка кількості органічних домішок у воді;
• сільське господарство (контроль бактеріологічної сировини та готової продукції);
• оцінка санітарного стану питної води;
• контроль якості води в електронній промисловості.

Сфери використання ЛАЛ-тесту різноманітні: контроль готової фармацевтичної продукції, контроль якості сировини, води для ін’єкцій, перевірка елементів фільтрів на вимивання з них пірогенів, чистоти ампул та флаконів, визначення оптимальних режимів миття, встановлення причин виявлення пірогенів у кінцевому продукті.

Уперше ЛАЛ-тест було внесено до Фармакопеї США в 1985 р., а пізніше його визнали в європейських країнах. Так, у 1999 р. на 104-й сесії Європейської Фармакопеї ЛАЛ-тест названо основним методом контролю якості лікарських засобів. Стратегія Європейської Фармакопеї у цьому напрямку — поступово замінити ним тест на пірогенність на тваринах у максимально можливій кількості препаратів. У липні 1999 р. у Фармакопейному комітеті України (Харків) відбувся науково-методичний семінар «LAL-тест при контролю якості ліків: сучасні вимоги та методологія», після чого його поступово впроваджено в практику контролю якості ліків на вітчизняних фармацевтичних підприємствах.

Першою вимогою до проведення ЛАЛ-тесту є визначення граничного значення ендотоксину в продукті, що тестується. Цей показник може бути вказано в монографії фармакопеї. Якщо він там відсутній, необхідно провести його розрахунок. Доповідач запропонувала аудиторії самостійно розрахувати показник граничного значення бактеріальних ендотоксинів на прикладі інсуліну.

Основними методами проведення ЛАЛ-тесту є:

1) гель-тромб тест (візуальна оцінка утворення твердого гелю);

2) напівкількісний гель-тромб тест (концентрацію ендотоксину в зразку можна визначити шляхом серії розведень);

3) турбідиметричний метод (інструментальне визначення утворення помутніння реакційної суміші);

4) хромогенний метод (утворення забарвлення в результаті введення в реакційну суміш хромогенного субстрату замість коагулогена);

5) колориметричний метод (визначення кількості осадженого ендотоксином білка за методом Лоурі).

Ю. Карпенко наголосила, що вибір методу залежить від типу та об’єму зразків, які тестуються, результату, який необхідно отримати, наявного обладнання тощо. Детально було розглянуто гель-тромб тест, його принцип та механізм проведення. Цей метод є фармакопейним, найпростішим та економічним. Для його реалізації змішують рівні кількості ЛАЛ-реактиву та зразка, ці реакційні суміші інкубують протягом 1 год при температурі 37 °С. Якщо утворюється твердий гель — результат вважають позитивним. Це означає, що концентрація ендотоксину дорівнює або є вищою, ніж чутливість ЛАЛ-реактиву. Якщо гель не утворюється — результат негативний. Це означає, що концентрація ендотоксину нижча, ніж чутливість ЛАЛ-реактиву. Перевагами цього методу є простота проведення, мінімум необхідного обладнання, добра відтворюваність результатів. Недоліком методу є неможливість кількісного визначення концентрації ендотоксинів.

Доповідач розповіла присутнім про необхідність ретельного відбору та підготовки зразків перед початком аналізу на вміст бактеріальних ендотоксинів. Важливо зазначити, що контроль вмісту бактеріальних ендотоксинів може бути проведено лише для лікарських засобів та субстанцій, переведених у розчинну форму. Ю. Карпенко звернула увагу на підготовку виробів медичного призначення, що зазвичай викликає ряд проблем. Перед початком аналізу слід провести розрахунок максимально допустимого розведення, а також попередню оцінку тест-системи, що полягає у підтвердженні заявленої чутливості ЛАЛ-реактиву та перевірці серій розведень контрольного стандарту ендотоксину (КСЕ).

Особливу увагу слухачів викликала частина доповіді, яка стосувалася принципу та технічних особливостей проведення гель-тромб тесту, інтерпретації та реєстрації результатів, отриманих у ході експерименту. Обговорювалися випадки отримання негативних результатів для позитивних контролів та позитивних результатів для негативних контролів, їх причини тощо.

Доповідач навела приклади отримання в ході експерименту хибнопозитивних (у результаті аналізу було встановлено, що вміст бактеріальних ендотоксинів перевищує норму при їх низькому вмісті) та хибнонегативних результатів (результат, при якому визначена концентрація ендотоксину нижча, ніж допустима норма при дійсному перевищенні його вмісту). У першому випадку причинами є, наприклад, вміст у зразку речовин, що викликають гелювання, крім ендотоксинів: тромбін, тромбопластин, пептидоглюкани тощо.

Причинами отримання хибнонегативних результатів є вміст у зразку речовин, що є інгібіторами реакції між бактеріальним ендотоксином та ЛАЛ-реактивом: антибіотики, гормони, алкалоїди, сечовина, хлорид натрію, диметилсульфоксид, антикоагулянти, що містяться в крові.

Другий випадок, безперечно, більш небезпечний, оскільки при цьому дозволяється до застосування пірогенний лікарський засіб. Випробуваний лікарський засіб може містити заважаючі фактори — речовини, що входять до складу випробуваного препарату та посилюють або пригнічують реакцію ЛАЛ-реактиву з бактеріальними ендотоксинами. Виявити це явище можна, порівнюючи здатність ЛАЛ-реактиву, що використовується в аналізі, реагувати з розчином КСЕ у ЛАЛ-воді та в розчині випробуваного лікарського засобу в стандартних умовах проведення експерименту. Якщо такі фактори є, необхідно зробити висновок про неможливість проведення випробувань на визначення бактеріальних ендотоксинів у випробуваному зразку.

У ході семінару обговорювалися практичні питання, а також детальний розгляд конкретних ситуацій та прикладів. Усі бажаючі могли поставити запитання, а також обмінятися думками та досвідом з колегами. Після закінчення семінару присутні отримали сертифікати.

Юлія Карпенко

Щотижневик "Аптека"